徕卡SP8 X白激光共聚焦显微镜操作规程.docx

公共实验室 1、 徕卡 SP8 X 白激光共 聚焦显微镜操作规程 1.1 开机程序 1.1.1 依 次 打 开 PC Microscope 、 Scanner Power、Laser Power 三个按 钮，将 Laser Emission 上的激光开关 钥匙旋至 On-1。 图 1 描仪 galvo-scanner，切记，不能用手 压或者放置重的物体。它偶尔产生高 频声音，是因为载物台没平衡好，无 法对任何机械漂移进行补偿，在 XZY 和 XYZ 模式之间切换有助于稳定平台。 关于物镜选择：选择 63x 物镜，不要 选择 100x 物镜用于普通共聚焦成像， 因为他们的数值孔径一致。共聚焦显 微镜的“放大倍数”由扫描区域而不 是物镜决定。 1.2.2 采用默认的 xyz 扫描模式，可 用于 xy 二维单张扫描（未设置 z-stack 参数时）和 xyz 三维层切扫描（设置 z-stack 参数时） 图1 1.1.2 打开 EL6000 荧光光源，打开需 要的激光电源。图 2 图2 1.1.3 双击电脑桌面 LAS X 图标，启动 共聚焦操作软件，进入配置选择界面 后，点击 OK，软件进行系统自检； 1.2.3 设置好激光百分比、发射光接受 范围（如 GFP 采用 488nm 激光，发射 光接受范围 500-550nm）、检测器增益 （PMT 增益一般不超过 800v，HyD 增益 一般不超过 100%） ，针孔大小（一般为 1AU），平均次数（2-4 次）； 关于 HyD: Counting 模式输出的是检 测到的光子数；Standard 模式输出的 是检测器上的累积电荷；BrightR 模式 1.1.4 系统自检完后，进入 LAS X 操作 是检测弱信号。Counting 模式对弱信 界面，点击界面最上方 Configuration 号特别有用，因为它可以提供更好的 按钮进入 Laser Config 界面→打开所 信噪比（该模式下最好选择 需激光（OFF→ON） ，Argon 激光还需拖 动右方滑块以调节激光输出初始功率； accumulated 参数）。Gating 是两个白 激 光 脉 冲 （ 80 MHz ） 之 间 的 间 隔 （12.5 ns）。可以用来去除自发荧光。 1.2.4 序列扫描：如果两个荧光发射光 1.2 xy 二维及 xyz 三维图像扫描程序 谱有重叠，例如 YFP 和 mCherry，DAPI 和 GFP，可以通过一次激发一个荧光的 1.2.1 选择合适倍数的物镜，轻轻移动 载物台样品夹，盖玻片朝下放置样品。 序列扫描 Sequential scan 来解决。 选择 SEQ【B1】，在每个序列中，选择 先使用粗聚焦旋钮聚焦样品，接近样 使用相应的激光和探测器，并选择序 品时换成细聚焦旋钮。旁边有一个开 列之间的切换是每行、每帧或每个 关，可在粗和精细移动之间切换（精 stack。每行的切换速度最快，所有荧 细速度确实很慢） 。在目镜下采用相应 光通道几乎同时预览。 的滤块，通过 smart move 找好样品的 焦距和感兴趣视野 1.2.5 预 览 ： 调 节 format 至 关于载物台：这是非常精密的振镜扫 512×512，点击 Live 活图预览，调至 公共实验室 合适的成像焦面及 zoom 放大倍数，通 过改变激光百分比和检测器增益将图 像调至合适亮度； 1.3.1 在 Project 界面下，点击 Open 打开.lif 后缀的原始文件，右键点击 图像文件名，选择 Export 进行图像输 出，可输出成图片（.tiff 或.jpeg）， 1.2.6 扫 描 采 集 ： 调 节 format 至 三维或多维图像还可输出成电影文件 （QuickTime、.avi、MPEG-4、WMV 等） 1024×1024 ， 选 择 合 适 的 扫 描 速 度 1.3.2 选择 As Tiff 或 As JPEG，可选 （lines/s, 400 Hz 适合绝大多数情 择输出路径、所需标尺及位置等，确 况，弱信号可以用 100 Hz）,合适的扫 定,点击 OK，即可将图像输出至指定路 描 区 域 Zoom Factor ， 点 击 Capture 径 Image 进行单张二维图片的拍摄 关于双向扫描 Bidirectional scan：扫描 1.3.3 若 输 出 电 影 文 件 时 速度增加一倍，但可能会出现假象（特 （ QuickTime、 .avi、MPEG-4、WMV 等）， 别是放大倍数高，扫描速度快的时候）。 设置好播放帧率及文件压缩百分比， 将文件输出值指定路径 1.2.7 若需进行三维扫描，在 Live 活 1.4 关机程序 图预览时，设置好 z-stack 中的 begin 1.4.1 保存已采集的图像。 和 end 的 z 轴位点，以及 z 轴层切的 步进，调节 format 至 1024×1024，点 1.4.2 在 LAS X 软 件 击 Start 进行逐层扫描 Configuration→Laser Config 界 面 关闭所有激光 关于氩离子激光器：如果有事需要中 断实验且时间间隔少于 1 小时，请关 闭激光开关钥匙，而不要关闭其余的 开关。 1.4.3 关闭 LAS X 软件 1.4.4 将 Laser Power 按钮右侧的激 光开关钥匙（Laser Emission）逆时 针旋转 90 度至 On-0 位置，等待约 5 分钟风扇停止后，关闭 Laser Power 按钮 1.4.5 关闭 Scanner Power 按钮 1.4.6 关闭 EL6000 荧光光源 1.4.7 先按显微镜旁边的 Z 按钮，将物 镜调下到安全位置，再移走样品。 1.2.8 点击 Save 图标，将文件保存至 目标文件夹 1.3 图像及电影文件输出 公共实验室 1.4.8 若使用过水镜头， 用擦镜纸擦干。 若使用油镜，需用无水乙醇清洁镜头， 擦拭物镜只能在一个方向上擦拭一次。 切勿重复使用擦镜纸。将物镜转至最 低倍数。 1.4.9 关 闭 电 脑 后 ， 关 闭 PC Microscope 按钮 1.4.10 做好仪器使用记录