非病毒基因活化机制转染ephrinB2用于内源性牙周组织再生的实验研究 _科创中国.docx

非病毒基因活化机制转染 ephrinB2 用于内源性牙周组织再生的实验研究 1.研究目标 （1）探索 ephrinB2-PEI GAMs 的最优制备方式，考察其转染效果，验证 PDLSCs 经 ephrinB2-PEI 复 合 物 转 染 后 的 成 骨 、 成 血 管 能 力 ， 明 确 将 ephrinB2-PEI GAMs 作 为 ephrinB2 体内移植载体的可行性。 （2）明确 ephrinB2-PEI GAMs 用于修复牙周组织缺损的疗效，包括牙周组织再生情况，血 管形成情况等，揭示可能的修复机制，为临床应用提供依据。 2.研究方法 （1）研究转染 ephrinB2 的犬 PDLSCs 促进缺损区成骨、成血管、组织再生的情况及机制 ① 比格犬牙周组织缺损模型的建立拔除比格犬双侧下颌第三前磨牙后，于第二前磨牙远中、 第四前磨牙近中分别磨除一定体积的牙槽骨，制备牙周组织缺损。 ② 犬 PDLSCs 的培养、转染、包埋、移植培养犬 PDLSCs 后，用慢病毒转染 ephrinB2， 然后将细胞包埋在 puramatrix 胶中，植入缺损区。 ③ 评价缺损区成骨、成血管、组织再生情况植入细胞 3 个月后，截取缺损区组织，micro-CT 摄片计算新生骨量；HE 染色分析新生骨、新生血管情况及牙周组织再生情况；免疫组化、 免疫荧光 Runx2/OPG/RANKL/CD31/SM）检测成骨、成血管情况及上下游分子表达情况。 （2）EphrinB2-PEI GAMs 的构建和转染效率检测 ① 摸索 ephrinB2- PEI GAMs 的最优制备方法采用梯度 N/P 比和梯度 DNA 剂量混合制备 DNA-PEI 复合物。将复合物与 PDLSCs 细胞混合孵育，使用流式细胞术鉴定基因转染效率。 制作纳米羟基磷灰石胶原，并将其与 DNA-PEI 复合物组装。 ② 评价 ephrinB2-PEI 复合物转染 PDLSCs 后，细胞增殖、迁移及基因、蛋白水平的变化 使用优化的 ephrinB2-PEI 复合物（Flag 作为对照组）转染 PDLSCs，3 天后收集细胞， CCK-8 检测细胞增殖，细胞迁移实验检测细胞迁移，Real-time PCR、Western blot 检测 ephrinB2、EphB4、Notch、DLL4、ALP 基因和蛋白的表达情况。 ③ 检测 ephrinB2-PEI 复合物转染 PDLSCs 后，自身成骨能力、促前成骨细胞成骨及促血 管形成能力的变化使用不同的 ephrinB2-PEI 复合物（Flag 作为对照组）转染 PDLSCs，3 天后收集细胞，检测自身成骨能力、促前成骨细胞成骨能力及促血管形成能力，检测方法同 前。 （3）EphrinB2-PEI GAMs 促进组织再生能力及机制的研究 制作比格犬牙周组织缺损模型，将不同的 ephrinB2-PEI GAMs 植入缺损区， Flag 作为对 照，并放置 bio-guide 膜避免牙龈纤维长入。3 个月后，截取缺损区组织，micro-CT、HE 染色、免疫组化分析成骨、成血管、组织再生情况，并使用免疫组化、免疫荧光分析局部细 胞成骨相关上下游分子表达的情况。 3.社会效益及研究成果 我们初步研究了不同浓度的 PDLSCs 包埋在 0.25% 的 puramatrix 中，以及 1×10 6 /ml 的 PDLSCs 包埋在不同浓度 puramatrix 中的增殖情况，并电镜下对包埋在 puramatrix 中的细胞形态进行了观察。将转染 ephrinB2 的犬 PDLSCs 植入牙槽骨缺损区，发现新骨形 成量明显高于对照组。非病毒基因活化基质（GAMs）可作为载体，实现 ephrinB2 质粒体内 递送，达到转染内源性干细胞，促进组织再生的目的。使用非病毒基因活化基质作为载体， 将 ephrinB2 信号分子导入牙周缺损区，转染内源性干细胞，可增强局部组织修复能力，促 进 牙 周 组 织 再 生 。 研 究 成 果 已 经 分 别 发 表 在 《 International Journal of Molecular Medicine》（影响因子：2.928）和《Journal of Tissue Engineering》（影响因子：4.148) 本项目的特色与创新之处； （1）使用非病毒基因活化基质进行内源性牙周组织再生，具有安全、简单、易 于接受的 优势，临床应用前景良好。 传统的牙周组织工程，需要体外培养种子细胞，存在细胞来源困难，培养周期长、费用高， 干细胞特性丧失等问题，限制了研究成果的进一步转化及临床应用。使用非病毒基因活化基 质进行内源性牙周组织再生，避免了体外细胞培养的诸多问题，具有安全、简单、易于接受 的优势，与临床应用衔接更紧密，可以更好的实现研究成果转化与临床应用。 （2）首次将 ephrinB2 信号分子用于牙周组织工程中。 EphrinB2 信号分子被证实在成骨和成血管过程中均发挥着重要的作用，不仅能促进骨组织 再生修复，同时也可以改善微循环障碍，有着双重功效，但 ephrinB2 对于牙源性干细胞 特性的影响作用及机制尚无报道。本科题首次研究 ephrinB2 信号分子对于牙源性干细胞 成骨、成血管、组织再生的影响，并创新性的将其用于牙周组织工程中，为牙周组织再生提 供了新思路。 （3）EphrinB2 信号分子可增强细胞迁移能力、促进牙源性干细胞成骨，并能促进周围 EphrinB2 血管新生，是理想的生物信号分子信号分子可促进牙源性干细胞成骨并增强细胞 迁移能力 牙周组织缺损主要是骨组织不同程度的丧失，骨再生是牙周组织再生的首 ephrinB2 要目的。 因此，信号 EphB4 分子应参与协同、激活或促进干细胞成骨。近期研究发现， 及其受体在 骨改建中发挥重要作用。当上调人牙周膜干细胞 信号分子后，细胞迁移能力增强，在成骨 诱 ephrinB2 导条件下，成骨标志基因 显著提高，形成的钙化结节显著增加。此外，高表达 的人牙周膜干细 ephrinB2 胞与成骨前体细胞共培养时，能够促进成骨前体细胞成骨。该结 果提示我们，EphrinB2 对牙源性干细胞的成骨能力也具有显著作用。 （4）EphrinB2/EphB4 通过调节成骨细胞和破骨细胞的分化来维持体内骨组织的动态平衡， 当干细胞的 ephirnB2 表达量提高时，可以更多与相邻干细胞的 EphB4 受体结合，促进成 骨细胞的形成，同时抑制破骨细胞的分化，从而提高成骨的效果。 我们的前期研究也发现，当上调人牙周膜干细胞 ephrinB2 信号分子后，自身成骨能力提高， 并能促进周围前成骨细胞成骨及血管内皮细胞形成血管网，可作为促进牙周组织再生的信号 分子。有报道称，PEI 可以实现间充质干细胞的高水平转染，避免了慢病毒转染存在的生物 危险性。PEI- 质粒可以同胶原、胶原-粘多糖、胶原-纳米羟基磷灰石等支架材料结合，构 建基因活化基质，植入体内后可以转染内源性干细胞高表达目的分子，实现内源性牙周组织 再生。已有学者使用非病毒基因活化基质成功转染 ephrinB2 到间充质干细胞中。基于 ephrinB2 的成骨、成血管能力，以及多领域非病毒基因活化基质的成功应用，所以我们提 出使用 ephrinB2-PEI GAMs 进行内源性牙周组织再生的实验 2、该项目应用现代细胞培养技术 RT-PCR 技术，免疫荧光技术影像诊断和图像 micro-CT、HE 染色、免疫组化染色技术，研究 ephrinB2 信号分子和牙周组织再生的关系 3、体内和体外研究表明：ephrinB2 分子促进比格犬牙周膜干细胞的成骨分化，进一步促进 了牙槽骨修复，具有安全、简单、易于接受的优势 4、项目成骨再核心期刊发表 sci 论文 3 篇，申请受理国家发明专利 1 项。 5、通过项目实施，团队学术水平提升，培养硕士研究生 3 人、培养国家一级学会委员 2 人、 江苏省医学会专业委员会副主任委员 1 人、江苏省“333”工程人才 1 人。 1、该项目应用现代细胞培养技术 RT-PCR 技术，免疫荧光技术影像诊断和图像 micro-CT、HE 染色、免疫组化染色技术，研究 ephrinB2 信号分子和牙周组织再生的关系 2、体内和体外研究表明：ephrinB2 分子促进比格犬牙周膜干细胞的成骨分化，进一步促进 了牙槽骨修复，具有安全、简单、易于接受的优势 3、项目成骨再核心期刊发表 sci 论文 3 篇，申请受理国家发明专利 1 项。 4、通过项目实施，团队学术水平提升，培养硕士研究生 3 人、培养国家一级学会委员 2 人、 江苏省医学会专业委员会副主任委员 1 人、江苏省“333”工程人才 1 人。 李长顺 男 1989.06 195837393@qq.com 主治医师 硕士研究生 朱绍跃 男 1984.03 zhushaoyuegg@163.com 主治医师 博士 张昕 女 1990.01 77474706@qq.com 主治医师 硕士研究生 袁长永 男 1983.11 24503692@qq.com 副主任医师 博士 王雯 女 1990.03 124247552@qq.com 主治医师 硕士